FORTEBIO的生物邏輯

我們的使命驅(qū)使我們盡一切可能開發(fā)出可以治愈疾病的重要生物制劑。通過提供客戶的產(chǎn)品，了解客戶研究背后的科學(xué)知識(shí)，提供的服務(wù)以及成為尋找研究挑戰(zhàn)解決方案的可信賴合作伙伴，我們可以使客戶擺脫工作流程的瓶頸。

FORTEBIO 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器

-動(dòng)力學(xué)等級(jí)

用于蛋白結(jié)合產(chǎn)物無標(biāo)記檢測(cè)的 Octet 生物傳感器代碼：18-5060，18-5061

開始試驗(yàn)前，請(qǐng)完整讀取整個(gè)產(chǎn)品說明書。僅供研究使用，不用于診斷程序。

O 垂直

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器能夠?qū)⑷?IgG 或其他含有人 Fc 區(qū)的蛋白固定在生物傳感器表面。固定化蛋白可用于后續(xù)的動(dòng)力學(xué)相互作用分析。事件  AHC 生物傳感器的表面設(shè)計(jì)為提供穩(wěn)定的相互作用，使其適用于苛刻的動(dòng)力學(xué)應(yīng)用。

  INTE 編號(hào)US E

ForteBio 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器，結(jié)合 Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)，設(shè)計(jì)用于大分子相互作用的動(dòng)力學(xué)分析。AHC 生物傳感器可用于許多樣品類型，包括純化蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物。

  P RI NCI PL E

使用抗人 IgG Fc 部分的高親和力抗體預(yù)固定抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器。該抗體可捕獲并固定人 IgG (hIgG) 或其他含 Fc 配體，以產(chǎn)生適用于相互作用分析的穩(wěn)定表面。捕獲表面特別適用于固定細(xì)胞培養(yǎng)上清液或其他復(fù)雜混合物中的 hIgG，其中生物素化不是一個(gè)選擇。

AHC 生物傳感器經(jīng)設(shè)計(jì)可耐受典型再生條件。在典型工作流程中，這允許捕獲目標(biāo) hIgG，分析人 IgG 與其分析物的結(jié)合，然后表面再生至其原始狀態(tài)。然后可以通過加載新的人 IgG 重復(fù)使用生物傳感器。

K I T C 打開

Octet QK 和 Octet RED 系統(tǒng)的抗人 IgG 捕獲生物傳感器包含：

將生物傳感器儲(chǔ)存在室溫下的干燥處，避免陽(yáng)光直射。將生物傳感器作為銳器處置。收到后，生物傳感器可穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月。

10x 動(dòng)力學(xué)緩沖液-10 mM 磷酸鹽、150 mM NaCl、0.02% 吐溫 20、0.05% 疊氮化納、1 mg/mL BSA (pH 7.4)。在 2-8 ℃ 下儲(chǔ)存直至失效。

  A DDITIO 編號(hào)M后結(jié)果R 等效 E D

需要以下附加材料：

• 人 IgG-可固定人 IgG 或其他含人 Fc 的蛋白。人 IgG 可以是純的，也可以是復(fù)雜混合物（如培養(yǎng)物上清液）的一部分。
• 調(diào)節(jié)/再生溶液-10 mM 甘氨酸 pH 值

表面處理和再生需要 1.7。根據(jù)固定分子，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化 pH 值。

• 相互作用蛋白
• 試驗(yàn)緩沖液-推薦 1X Kinetics 緩沖液（用 PBS (pH 7.4) 以 1:10 稀釋 10X Kinetics 緩沖液）。可使用其他緩沖液。在整個(gè)生物傳感器水合和所有測(cè)定步驟中，緩沖液保持一致時(shí)觀察到的結(jié)果。
• Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)
• 96 孔微孔板-2 X 96 孔、黑色平底聚丙烯微孔板 (Greiner Bio-one#655209)

T EC HN IQUE SFO RO PTIMA LP ER FO RM AN CE

1. 在加載步驟之前，需要對(duì)生物傳感器進(jìn)行調(diào)節(jié)，以改善基線和表面穩(wěn)定性。通常調(diào)節(jié)包括 3 X 20 秒暴露于再生緩沖液和 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液交替。
2. 對(duì)于嚴(yán)格的應(yīng)用，建議使用由結(jié)合和再生循環(huán)組成的生物傳感器表面的“主要”。該預(yù)充結(jié)合循環(huán)應(yīng)包括從溶液中捕獲 hIgG，然后使用再生方案再生回原始表面。應(yīng)在表面處理后進(jìn)行預(yù)充。
3. 通常，生物傳感器表面的再生可以通過 5 X 5 秒暴露于 10 mM 甘氨酸 pH 1.7 與 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液交替實(shí)現(xiàn)。在某些情況下，可能需要根據(jù) hIgG 進(jìn)一步優(yōu)化再生。
4. 為了獲得良好性能，應(yīng)包括一個(gè)參考生物傳感器。參比生物傳感器應(yīng)加載 hIgG，并應(yīng)使用用于結(jié)合和解離步驟的緩沖液空白運(yùn)行。
5. 制備前，將試劑和樣本平衡至室溫。對(duì)于冷凍樣本，使用前解凍并充分混合。
6. 在 Octet 系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定前，需要對(duì)生物傳感器進(jìn)行水合。生物傳感器在與整個(gè)試驗(yàn)過程中使用的緩沖液一致的緩沖液中水合將得到穩(wěn)定的結(jié)果。
7. 檢測(cè)樣本和生物傳感器水合溶液所需的小體積均為 200 μL/孔。
8. 確保 Octet 儀器打開，并在開始測(cè)定前將燈預(yù)熱至室溫至少 40 min。
9. 選擇文件 <unk>，在 Octet 軟件中設(shè)置樣品板溫度 實(shí)驗(yàn) <unk>  設(shè)置板溫度。輸入  所需溫度。ForteBio 建議測(cè)定  在 30 °C 下測(cè)定。在其他溫度下測(cè)定可能需要與本方案中討論的不同的測(cè)定時(shí)間。

  P RO 至 CO LO 垂直

1. 制備緩沖液、再生溶液、配體和相互作用的蛋白樣品。
2. 移取 200 μL 適當(dāng)?shù)乃先芤海糜?96 孔板中。將水合板插入，然后將生物傳感器置于生物傳感器托盤上，以水合生物傳感器。
3. 將 200 μL 各適當(dāng)樣品或緩沖液轉(zhuǎn)移至 96 孔板的適當(dāng)孔中。
4. 在 Octet 儀器上平衡水合生物傳感器組件和樣品板 10 min。
5. 開始試驗(yàn)。
6. 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并保存結(jié)果。

  S AMPL EP RE PA RA TI ON

制備前將試劑和樣本平衡至室溫，并充分混合。

1. 人 IgG 或其他含 Fc 配體– 配體是固定在生物傳感器表面的蛋白質(zhì)。含 Fc 配體的典型固定濃度為 5-25µg/mL。每個(gè)孔需要 200µL 配體。試驗(yàn)后可從微孔中回收配體溶液，并根據(jù)需要重復(fù)使用。

如果從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲配體，如果用 1X Kinetics 緩沖液將上清液以至少 1:2 稀釋，則可獲得宜結(jié)果。如果該稀釋導(dǎo)致配體的總濃度較低，則生物傳感器可與細(xì)胞培養(yǎng)物在 4 C 下孵育過夜，以使含配體的 Fc 的上樣量大化。關(guān)于過夜裝載的提示，請(qǐng)參見  技術(shù)說明TN3010_ 鏈霉親和素批次固定.

1. 相互作用蛋白-在嚴(yán)格的動(dòng)力學(xué)分析期間，建議運(yùn)行至少 4 種不同濃度的

   以稀釋系列形式相互作用的蛋白質(zhì)。高濃度應(yīng)比預(yù)期 KD 高約 10 倍。例如，對(duì)于預(yù)期具有低 nM 親和力的相互作用，相互作用蛋白的濃度 90 nM、30 nM、10 nM 和 3 nM 通常可提供良好的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。每份樣品需要 200µL 蛋白溶液的微孔體積。

   對(duì)于篩選試驗(yàn)或定性相互作用分析，相互作用蛋白的單一濃度足以表征結(jié)合。

2. 調(diào)節(jié)/再生溶液-抗人 IgG 捕獲生物傳感器可通過使用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 再生至捕獲表面水平。再生后，生物傳感器可重新加載 hIgG，用于新的相互作用分析。在重復(fù)再生中觀察到結(jié)合力的小幅損失。為了穩(wěn)定表面，建議執(zhí)行初始調(diào)節(jié)步驟。該調(diào)節(jié)包括在*相互作用試驗(yàn)前將生物傳感器暴露于再生緩沖液。

3. 對(duì)于分析的特定 hIgG/相互作用蛋白，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)節(jié)/再生溶液的 pH 值。

   O 尼龍 EIMMOBILIZATIO NP RO 至 CO L

   以下是在線固定中使用的典型檢測(cè)步驟列表。這些步驟由 Octet 系統(tǒng)*自動(dòng)化。

4. 基線（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液或培養(yǎng)基樣品）
5. 處理（推薦）。將生物傳感器暴露于再生溶液，以優(yōu)化基線性能并穩(wěn)定面密度。
6. 預(yù)充綁定循環(huán)（可選）
7. 配體上樣（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液或培養(yǎng)基樣品）
8. 基線（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
9. 相互作用蛋白的關(guān)聯(lián)（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
10. 解離（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
11. 再生（10 mM 甘氨酸，pH 1.7）

12.  

13. 試驗(yàn)準(zhǔn)備 - 按照上述樣品制備章節(jié)所述，制備緩沖液、再生溶液、配體和相互作用蛋白。

14.  

15. 測(cè)定板 - 根據(jù)表 1 中的微孔板分布圖，將 200 μL 各檢測(cè)試劑轉(zhuǎn)移至 96 孔黑色平底聚丙烯微孔板中。

16.  

    	1	2	3	4	5	6	7
    A	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    B	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    C	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    	… …	…	…	…	…	…	…
    H	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	緩沖液	緩沖液

    表 1.接骨板分布圖示例。

     

    生物傳感器水化板制備-小心地從生物傳感器托盤組件上取下黃色生物傳感器架的頂部，并放置在工作臺(tái)上。將黑色 96 孔板牢固地放置在藍(lán)色生物傳感器托盤支架中。將 200 μL 水合溶液轉(zhuǎn)移到微孔板中與正在使用的生物傳感器的數(shù)量和位置相匹配的每個(gè)孔中。高度

    建議在整個(gè)試驗(yàn)過程中使用的相同緩沖液中水合生物傳感器。

     

    將生物傳感器架與水合板對(duì)齊，更換生物傳感器架，注意不要刮擦或接觸生物傳感器底部。至少水合生物傳感器至關(guān)重要10 min在 Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)上。

17. 生物傳感器和樣品板的儀器放置-將帶有 A1 的樣品板朝向 Octet QK 儀器或 Octet RED 儀器中樣品板載物臺(tái)的右后角放置。

18. 將生物傳感器托盤放在 Octet 儀器左手側(cè)的生物傳感器平板臺(tái)上。

    確保生物傳感器托盤和樣品板均牢固就位。進(jìn)入“儀器準(zhǔn)備和編程”。

      I結(jié)構(gòu) TPRE pa RA TI Ona daP RO GR AM IN G

    確保 Octet 儀器及其計(jì)算機(jī)已打開。必須將燈預(yù)熱至少 40 min。

    雙擊 Octet User Software 圖標(biāo)     并允許 Octet 完成初始化。從菜單中選擇實(shí)驗(yàn)

    è    新   動(dòng)力學(xué)  實(shí)驗(yàn)  (Ctrl + K) . 按照以下順序填寫每個(gè)選項(xiàng)卡所需的信息：

     

        傳感器 <-> 樣本分配

19. 使用鼠標(biāo)突出顯示生物傳感器板中使用的傳感器（方塊）。傳感器信息可直接輸入表格。
20. 使用鼠標(biāo)突出顯示含有樣本或試劑的孔。可將樣本信息直接輸入表格。
21. 輸入相互作用蛋白的濃度值。
22. 點(diǎn)擊“+“或“添加”執(zhí)行測(cè)定所需的測(cè)定步驟數(shù)。
23. 定義每個(gè)測(cè)定步驟。
    1. 在“數(shù)據(jù)名稱”下，雙擊更改步驟名稱
    2. 分析時(shí)間
    3. 在“流速”項(xiàng)下，輸入軌道流量振蕩器的 rpm。所有動(dòng)力學(xué)步驟（基線、締合和解離步驟）均應(yīng)在 1000 rpm 流速下進(jìn)行。
    4. 在“類型”下，從下拉菜單中選擇步驟類型。
24. 通過按應(yīng)執(zhí)行的順序分配生物傳感器、樣本及其相關(guān)試驗(yàn)步驟，創(chuàng)建試驗(yàn)方案。
    1. 點(diǎn)擊包含您希望使用的生物傳感器的列，選擇生物傳感器列。
    2. 從以下選項(xiàng)中選擇個(gè)定義的測(cè)定步驟步驟數(shù)據(jù)設(shè)置單擊該表。

25. 雙擊選定步驟中要使用的樣品列。該步驟將顯示在“檢定系統(tǒng)設(shè)置列表”中

     

        檢測(cè)定義

    在表 2 中，“步驟數(shù)據(jù)設(shè)置”是帶有相關(guān)參數(shù)的可編程步驟的示例列表。下表列出了典型檢測(cè)的步驟順序。

    如果運(yùn)行啟動(dòng)結(jié)合循環(huán)，則在上樣含配體的人 IgG 或 Fc（步驟 9）后，通過 5 次再生循環(huán)再生生物傳感器。啟動(dòng)后，生物傳感器應(yīng)重新加載含配體的人 IgG 或 Fc，并從步驟 8 開始運(yùn)行試驗(yàn)。

1. 在選擇下一列生物傳感器之前，完成剩余試驗(yàn)步驟。

表 2.檢測(cè)步驟和相關(guān)參數(shù)示例。再生后，重復(fù)步驟 8-22 以重新加載并進(jìn)行下一次試驗(yàn)。* 在 Octet QK 上，使用 Regen 步驟類型。在 Octet RED 上，使用自定義步驟類型。

    運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

1. 選擇瀏覽按鈕，保存原始數(shù)據(jù)的位置。強(qiáng)烈建議將數(shù)據(jù)保存到本地驅(qū)動(dòng)器 (C:/)。運(yùn)行完成后，可將數(shù)據(jù)傳輸至網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動(dòng)器。
2. 輸入實(shí)驗(yàn)運(yùn)行名稱（子目錄），其為所有原始數(shù)據(jù)文件和與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的實(shí)時(shí)綁定圖表創(chuàng)建一個(gè)新文件夾。  如果默認(rèn)名稱不可接受，輸入板名稱。
3. 勾選“延遲實(shí)驗(yàn)開始框”。輸入 300 秒，使樣品達(dá)到測(cè)定溫度所需的平衡時(shí)間為 5 min。
4. 默認(rèn)設(shè)置將確保自動(dòng)保存運(yùn)行時(shí)圖表。
5. 點(diǎn)擊開始試驗(yàn).